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基因表达分析（上）

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基因表达

什么是基因表达，如下是来自于维基百科的解释：


Gene expression

is the process by which information from a

gene

is used in the synthesis of a functional

gene product

. These products are often

proteins

, but in non-protein coding genes such as

transfer RNA (tRNA)

or

small nuclear RNA (snRNA)

genes, the product is a functional

RNA

. The process of gene expression is used by all known life—

eukaryotes

(including

multicellular organisms

),

prokaryotes

(

bacteria

and

archaea

), and utilized by

viruses

—to generate the

macromolecular

machinery for life.

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Flow of genetic information

研究方法

定量PCR

这部分我不太懂，所以就放几段百度百科和维基百科的定义。

  • 百度百科

定量PCR（即时聚合酶链锁反应，Real-time Polymerase Chain Reaction，简称 Real-time PCR、即时PCR），又称定量即时聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction，简称 Q-PCR/qPCR/rt-qPCR、定量即时PCR、即时定量PCR），是一种在DNA扩增反应中，以萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的方法技术，有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果（扩增效率为零）。

  • 维基百科

A real-time polymerase chain reaction (Real-Time PCR), also known as quantitative polymerase chain reaction (qPCR), is a laboratory technique of molecular biology based on the polymerase chain reaction (PCR). It monitors the amplification of a targeted DNA molecule during the PCR, i.e. in real-time, and not at its end, as in conventional PCR. Real-time PCR can be used quantitatively (quantitative real-time PCR), and semi-quantitatively, i.e. above/below a certain amount of DNA molecules (semi quantitative real-time PCR).

优点：灵敏性高，准确性高，通量也还行。一般而言，RNA-Seq和microassay分析得到的差异表达基因最终也需要通过这种实验方法进行验证。

但是一般适用于验证实验，而不是用于探索性实验。

microarray<small>基因矩阵</small>

基因芯片的概念在上个世纪80年代就已经提出来了， 被评为1998年度自然科学领域十大进展之一。他的基本原理通过设计专门的短核苷酸作为探针，把这些探针固定在专门的基片表面，然后用样本的cDNA进行杂交，根据杂交信号的强弱来判断基因表达的程序。

img_e0fffefa81138d11070a64801aa077fe.png

microarray

但是microarray检测的基因数量完全取决于你的探针设计的数量，而且难以研究mRNA的可变剪切。

RNA-Seq

RNA-Seq是目前基因表达分析最常用的技术。分为以下几步

  • 分离所有mRNA
  • 逆转录mRNA成cDNA
  • 对cDNA测序
  • 比对参考基因组

RNA-Seq实验设计中的“重复”包括：技术重复和生物学重复

重复是为了检测组间和组内的变异，对于假设检验至关重要。

  • 技术重复为了估计测量技术（RNA-Seq）的变异。
  • 生物学重复是为了发现生物组内的变异。

    简单的说，两组的基因表达的变化只有比组内变异还大时才能认为时显著的。

RNA-Seq的概率分布

相同基因在不同细胞的表达水平服从log-normal(对数正态)分布，由定量PCR验证。（

注

：这与相同细胞不同基因表达的分布不同）但是大多数基因表达实验都是用一群细胞，几乎没有相应分布提出。

RNA-Seq试验中，抽样得到的raw read counts服从泊松分布。并且同一样本在两次试验中的结果不同，这称为shot noise。这种变异在RNA-Seq

技术重复

间成为Possion noise。

生物学上不同的样本间的差异服从负二项(negative binomial)分布,有时称gamma-Poisson分布。

由于RNA-Seq count数据也表现出zero inflation(大量值为0)的特征，所以很难拟合到负二项分布，所以有文章认为要用Poisson-Tweedie family建模。

RNA-seq数据和microassay在差异表达分析上的区别：

  • RNA-Seq观察到的数据是抽样过程中产生的离散（discrete）count形式。也就是说总体是恒定的，表达量越高的基因在抽样结果中所占的比例越大。表达量低的基因可能即便有也无法被检测出来。当然，重新对相同文库进行测序，还是有可能找到更多表达的转录本

  • microassay检测的是荧光信号的连续度量。由于使用固定的核酸序列去杂交，所以不是一种“零和游戏”，只要能杂交，就能被检测。（但如果没有设计相应的引物，就不能检测到可能的基因）

研究意义

1.在不同背景下比较mRNA水平

  • 同一物种，不同组织：研究基因在不同部分的表达情况
  • 同一物种，同一组织：研究基因在不同处理下，不同条件下的表达变化
  • 同一组织，不同物种：研究基因的进化关系
  • 时间序列实验： 基因在不同时期的表达情况与发育的关系

2.基因